熒光定量服務(wù)


熒光定量PCR的基本原理就是在PCR擴增過(guò)程中，隨著(zhù)PCR循環(huán)數的遞增，PCR產(chǎn)物不斷積累，熒光信號也會(huì )相應的增加，這樣就可以通過(guò)熒光強度的變化來(lái)對PCR反應進(jìn)行實(shí)時(shí)的監測，并以b-Actin或GAPDH等管架基因作為內參照，對目的基因的表達量進(jìn)行半定量檢測。

科佰生物將根據您的科研需求可以提供SYBR Green染料法和TaqMan探針?lè )?。通過(guò)對DNA或RNA的熒光定量PCR監測, 實(shí)現基因的相對定量、定量和定性分析。

SYBR Green熒光染料法：適用于任何DNA，無(wú)需設計探針，采取雙標準曲線(xiàn)法，實(shí)驗周期短，結果重復性好，靈敏度高。

TaqMan熒光探針?lè )ǎ?/strong>經(jīng)驗豐富的實(shí)驗技術(shù)人員設計探針，對目標基因有高特異性，實(shí)驗重復性好，相對于SYBR Green法，靈敏度更高。

1.定量：

定量首先必須構建與檢測樣品目的基因具有相同序列的標準品。使用已知濃度的標準品制作3個(gè)點(diǎn)以上的標準曲線(xiàn)后，可以使用標準曲線(xiàn)對未知濃度的檢測樣品進(jìn)行量（起始拷貝數）分析。

2.相對定量（mRNA表達量分析）：

基因表達的研究一般采用相對定量的方法。相對定量法必須對樣品的目的基因和參比基因內標同時(shí)分別進(jìn)行定量，然后求出對于參比基因的目的基因的相對量。通過(guò)對樣品間的目的基因的相對量進(jìn)行比較，可以對不同樣品間的mRNA進(jìn)行表達量分析。參比基因通常選用表達量相對恒定的House Keeping Gene，如：GAPDH、b-actin等。通過(guò)同時(shí)對參比基因的實(shí)時(shí)檢測，可以對樣品之間由于起始細胞數不同、或RNA提取效率的不同等造成的RNA量誤差進(jìn)行校正，達到在嚴格意義上對樣品之間的mRNA表達量進(jìn)行分析之目的。

1、總 RNA 提取及定量；

2、PCR 引物設計及反轉錄；

3、熒光引物設計（SYBR Green 熒光染料法）/探針設計（TaqMan 熒光探針?lè )?；

4、熒光定量PCR，進(jìn)行擴增曲線(xiàn)、溶解曲線(xiàn)、表達量差異分析等實(shí)驗；

5、數據分析與處理；

6、完整實(shí)驗報告。

樣品要求：

1.樣品可提供組織、細胞、RNA、cDNA中的一種,對于提供樣本的大致原則如下：組織樣本,盡可能提供2×2×2mm3體積或以上,新鮮組織可直接提供，不需處理；對于細胞樣本，盡可能提供3×10^6個(gè)細胞左右,加適量Trizol處理即可，確保樣品適于RNA抽提。RNA、cDNA含量根據同等細胞數量的細胞抽提和逆轉錄大致界定, 如果提供RNA或cDNA我們要對您提供的材料進(jìn)行評估。

2.客戶(hù)提供盡可能詳細的背景信息；物種信息，擴增目的基因的NCBI登錄號等。

3.運輸要求，液氮或干冰保存寄送。

注：樣本應避免各類(lèi)污染和反復凍融。

提交的產(chǎn)品和資料：

1.RNA濃度及熒光定量PCR原始數據及分析結果；

2.熒光定量PCR完整的實(shí)驗步驟、使用儀器、軟件設置參數等。